Le PCR copie à plusieurs reprises une partie du génome de l'agent. D'après les directives de l'IRM, les méthodes les plus courantes de détection des acides nucléiques ~ PCR avec ses variantes et l'application isothermique. Les produits de la réaction se voient de différentes manières: gel agaros, sondes (par exemple TaqMan), accumulation en temps réel. Les séries de PCR de FACTOR sont conçues pour les PCR en temps réel, et il existe également une variante pour le virus de l'AFC avec un enfant électrophorétique.
Les techniques moléculaires détectent les séquences génomiques des micro-organismes vivants et morts pendant que l'acide nucléique est présent dans l'échantillon. D'où la différence fréquente: l'échantillon est positif dans les PCR et négatif lorsqu'il s'agit d'un virus. L'OMSA recommande de traiter ces cas par séquençage ou par d'autres méthodes moléculaires.
L'analyse se décompose en quatre étapes: réception et traitement primaire du matériau, extraction d'acides nucléiques, préparation du mélange réactionnaire et assimilation, compte tenu des résultats. Le MS 1.3.2569-09 transforme ces étapes en zones d'exploitation successives (p. 5.8):
Реакционные смеси готовят до того, как в зону 3 доставят пробы из зоны 2 (п. 5.11.1). Саму зону 3 рекомендуют делить на подзоны 3а (смеси и обратная транскрипция) и 3б (амплификация и учёт) в отдельных помещениях (п. 5.11.2). Зоны 4-1 и 4-2 размещают изолированно от зон 1–3, чтобы продукты амплификации не попали туда с воздушным потоком; объединять их запрещено (п. 5.12, 5.12.3). Мебель и оборудование каждой зоны маркируют, применять в других зонах не разрешается (п. 5.14.2). В зоне 3 приток воздуха равен вытяжке, в зонах 1 и 2 вытяжка преобладает (п. 5.13.1, 5.13.2). Измерительные приборы поверяют не реже раза в год (п. 5.15).
La direction de la WRA exige la même chose. En raison de la grande sensibilité de la méthode, il faut des locaux ou des boxes séparés pour certaines phases, changer les chapeaux et les gants, mettre en place un programme strict de nettoyage.
Le choix commence par la nature du génome de l'agent. Par exemple, le virus de la peste porcine africaine, le virus de la dermatose nodulaire contagieuse, le virus du leucémie du CDC. ARN cible, par exemple, le virus de la grippe A.
Pour l'ARN, une transcription inverse est mise avant l'application: l'enzyme synthétise l'ADN, et le PCR normal suit. C'est pourquoi le recrutement PCR-INFLUENZA-A-FAKTOR fonctionne sous la forme d'un PCR PB. L'échantillon d'ADN/ARN-CAFOR décrit par le fabricant est destiné à l'extraction d'ADN/ARN suivie d'une transcription inverse et d'un PCR.
Trois conclusions pratiques s'en dégagent. Dans la liste de contrôle pour le test d'ARN, l'OMSA ajoute le contrôle de la transcription inverse. Le manuel MIQE exige une évaluation de l'ADN génomique résiduel dans les préparations ARN, c'est-à-dire qu'on compare Cq à la transcription inverse et sans. Les virus de l'ARN changent rapidement, des mutations ponctuelles sont possibles, donc la RUJ recommande de vérifier périodiquement les séquences des premiers et des sondes.
L'appareil mesure la fluorescence après chaque cycle. Le numéro du cycle où le signal franchit le seuil est indiqué dans le manuel Ct (cycle threshold) dans le manuel MIQE Cq (quantification cycle).
Cq montre la position de la courbe d'amplitude par rapport à l'axe des cycles et est directement liée à la concentration de référence de la cible: plus il y a de copies en réaction, plus tôt la courbe franchit le seuil. Les restrictions commencent. Les valeurs de Cq diffèrent entre les pièces et les instruments, de sorte qu'il n'est pas possible de les comparer aux laboratoires. Ils dépendent fortement de l'efficacité des PCR, qui varie d'un ensemble à l'autre et même d'échantillons différents. Le seuil, l'efficacité de la réaction, le nombre de matières brutes, les artefacts de réaction, les erreurs de pipet et la variation de l'échantillon influent sur la dispersion.
Le seuil d'extinction indique les instructions pour le recrutement. L'OMSA donne l'exemple suivant: le seuil de 35 cycles est parfois approprié, et les échantillons à gros Ct sont considérés comme négatifs ou douteux. Pour un autre PCR, tout Ct enregistré est considéré comme positif. Les valeurs entre les seuils positifs et les seuils négatifs sont qualifiées de zones douteuses. En choisissant le seuil, on tient compte des caractéristiques des PCR, des données de validation, de l'affectation du résultat et des données vétérinaires sur les animaux.
Les cartes d'ensemble de l'AFC, de la grippe A, de la dermatose nodulaire contagieuse et du leucémie du CRS indiquent une combinaison de 55 ou 110 réactions, y compris des contrôles (VBC, PBC, OCS). Les règles de déchiffrement sont prises en compte dans les instructions de recrutement. Au sens du terme, ils couvrent différents risques.
| Suivi | Ce qui montre | Combien de fois on met |
|---|---|---|
| Négatif, échantillon sans matrice | Contamination: signal là où le produit ne doit pas être | - Environ 5% des trous, par accident. MIQE: dans chaque pièce, téléchargée en dernier |
| Positif | Que la réaction est passée; Son Ct entre dans la plage de fonctionnement spécifiée | Pour chaque tablette |
| Inhibiteurs internes | qu'il n'y a pas de matières dans l'échantillon, une réaction massive | pour chaque échantillon si les inhibiteurs sont pertinents pour cette matrice |
| Vidéo-maître | que l'échantillon a été effectivement touché par le genre d'animal. | pour les échantillons de cosmétiques, tels que ceux collectés sur une tamponne, pour chaque échantillon |
| La transcription inverse | La synthèse de l'ADN a été entreprise. | dans les tests d'ARN |
Положительный контроль в виде плазмиды проверяет амплификацию, но не качество выделения. Для оценки выделения нужна известная положительная проба. Внутренний контроль не сработал – значит, в пробе есть ингибиторы, и отрицательный результат по мишени недостоверен. MIQE подчёркивает отдельно: положительные контроли нужны там, где копий мало и важна уверенность в отрицательном результате, то есть именно при выявлении патогенов.
La stabilité de l'ensemble est contrôlée sur la base de cartes de référence des valeurs de Ct pour les échantillons de surveillance de service et par le biais d'essais comparatifs interlaboratoires.
Le résultat du laboratoire dépend de la qualité et de l'aptitude des échantillons. Le matériel est défini dans la définition de chaque kit.
| Ensemble (cat. №) | La cible | Support de la carte de sélection |
|---|---|---|
| PCR-ASF-FAKTOR (D10415-VET) | ADN du virus de l'ACV | Du sang entier, du plasma et du sérum sanguin, des frottis avec des muqueuses et des amandes, des fragments d'amandes, de rates, de poumons, de foie, de ganglions lymphatiques, etc. |
| PCR-BOVINE-LUMPY-SKIN-DISEASE-FAKTOR (D21416-VET) | ADN du virus de la dermatose nodulaire contagieuse | Défauts de peau, organes, sang entier, frottis et rotatisations, lait, sperme |
| PCR-INFLUENZA-A-FAKTOR (R10515-VET) | ARN du virus de la grippe A | Fécales et détergents, frottis de muqueuses et trachées, séchages d'oiseaux, fragments d'organes internes, embryons de poulet, fourrage et produits animaux |
| PCR-BOVINE-LEUKOSIS-FAKTOR (D11816-VET) | L'ADN du virus de la leucémie | Sang entier; Alimentation (farsh, saucisses, épices, etc.) |
Une partie des matrices est très difficile. Les fécales, le sperme et les tissus autolysés contiennent généralement plus d'inhibiteurs que le sang et les cultures. Les échantillons cloaciques sont plus souvent prélevés sur les inhibiteurs que sur la bouche. Les tampons ont également une influence: certains tampons contiennent des substances, et la réaction est énorme. Les tests individuels sont incompatibles avec l'héparine, la formaline, la glace sèche et même le gel.
Les délais et les anticoagulants sont fixés par le règlement vétérinaire pour une maladie donnée:
Les échantillons des tampons sont conservés humides dans l'environnement de transport recommandé pour le test spécifique. Les fécales sont conservés réfrigérés, par exemple à 4 °C ou sur de la glace, et ils sont étudiés dès que possible après la sélection.
Le résultat est positif: il y a une cible dans l'échantillon. On a besoin de précisions.
Le poids juridique du résultat est fonction des règles relatives à une maladie donnée. Le diagnostic de l'AHF est considéré comme établi lors de la mise en place et/ou de la détection d'un agent antigène et/ou d'un matériel génétique, et/ou d'un anticorps à l'agent (p. 28 du Règlement No 37).
Dans le Règlement no 156 sur le leucémie, la liste des motifs de diagnostic est différente: études hématologiques, hystologiques et sérologiques. Les PCR ne figurent pas sur cette liste, bien que la réglementation exige que les PCR soient exécutés selon la méthode des PCR (p. 20, 21). Ici et au-dessus, le Règlement no 156 est cité dans la version en vigueur depuis le 1er septembre 2025: l'arrêté du Ministère russe de la santé du 8 avril 2025. No 229 a modifié les paragraphes 18, 19 et 21 et complété le règlement par le paragraphe 21 (1).
La partie laboratoire de l'examen s'appuie sur les directives de l'OMSA:
Les deux fonctions du laboratoire sont définies dans le Règlement no 37, que le résultat soit douteux ou non. Tous les échantillons sont divisés en deux parties égales. Le second doit être conservé pendant au moins 30 jours civils à une température comprise entre -15 et -40 °C; il doit faire l'objet d'une nouvelle étude à la demande de ceux qui contestent le résultat (p. 26). Les résultats sont communiqués par écrit par le directeur du laboratoire au directeur de l'autorité vétérinaire régionale et au spécialiste de la santé publique qui a envoyé le matériel dans un délai de 12 heures (par. 29).
СанПиН 3.3686-21 (постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 № 4) в п. 140 отсылает к требованиям по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности. Конкретный документ пункт не называет. Действующий документ с таким названием – МУ 1.3.2569-09, утверждённые 22 декабря 2009 года: зонирование, поточность движения проб, маркировка оборудования, вентиляция, поверка приборов.
Руководство ВОЗЖ добавляет уровень системы качества. Для признания результатов и аккредитации по ISO/IEC 17025 лаборатории нужна система менеджмента качества. В неё входят валидированные методики и подтверждённая квалификация, в том числе через регулярное участие в межлабораторных сравнительных испытаниях.
Des échantillons spécifiques, des délais et des motifs de diagnostic sont recherchés dans les règles vétérinaires relatives à la maladie. La comparaison entre le Règlement no 37 et le Règlement no 156 montre à quel point le rôle des PCR est différent selon les maladies.
C section CCR Un catalogue de plus de 130 ensembles d'autoproduction, dont plus de 100 ont pour but de détecter les agents pathogènes chez les animaux, les oiseaux, les poissons et les abeilles. La phase est indiquée sur la carte de recrutement, la plupart ayant 55 et 110 réactions.
Pour la sélection des acides nucléiques:
Exemples de PCR pour différents types de cibles:
Les instructions s'ouvrent dans le bureau personnel une fois que l'accès a été confirmé et peuvent également être demandées par le bouton " Demander l'instruction " dans la fiche de sélection. Les spécialistes de VET FAKTOR vous aident à choisir les kits adaptés aux besoins et à l’équipement de votre laboratoire : +7 (495) 789-48-11, vet@faktor.ru.
Le PCR cherche de l'acide nucléique, un anticorps ELISA ou un antigène. Le Règlement no 37 autorise les deux méthodes (par. 27). Le diagnostic de l'AHF est considéré comme établi lors de la mise en place et/ou de la détection d'un agent antigène et/ou d'un matériel génétique, et/ou de l'anticorps à l'agent (p. 28).
Non. Ct est lié au nombre de copies de la cible en réaction, mais dépend du seuil, de l'efficacité des PCR, de la qualité du prélèvement et de l'instrument. Les valeurs n'étant pas comparables entre laboratoires, elles ne sont pas transférées du protocole d'autrui et ne sont pas considérées comme une mesure de gravité.
Cette différence est décrite dans le manuel de l'OMSA: les méthodes moléculaires permettent de détecter les séquences des micro-organismes vivants et des micro-organismes morts. Détecter la différence par séquençage ou par une autre méthode moléculaire.
Les raisons sont les suivantes: le contrôle interne n'a pas fonctionné (les inhibiteurs dans la matrice), les délais de livraison ont été dépassés, le matériel ne convient pas au test. Tous les trois rendent le résultat négatif non informatif.
Исследования по детекции нуклеиновых кислот ПБА проводят по требованиям к лабораториям, использующим методы амплификации (п. 140 СанПиН 3.3686-21). МУ 1.3.2569-09 допускают не только отдельные помещения, но и выделенные рабочие зоны в составе других помещений при соблюдении поточности (п. 5.2, 5.8).
Ce document est fourni à titre informatif et ne remplace ni les règles vétérinaires ni l’avis d’un professionnel vétérinaire. Le diagnostic est établi à partir des résultats des analyses de laboratoire, selon la procédure prévue par la législation.
© 2015–2026 VET FAKTOR. Tous droits réservés.
