ПЦР многократно копирует заданный участок генома возбудителя. По руководству ВОЗЖ, самые распространённые методы выявления нуклеиновых кислот – ПЦР с её вариантами и изотермическая амплификация. Продукты реакции видят по-разному: в агарозном геле, мечеными зондами (например, TaqMan), по накоплению продукта в реальном времени. Наборы раздела ПЦР у ВЕТ ФАКТОР рассчитаны на ПЦР в режиме реального времени, а для вируса АЧС есть ещё и вариант с электрофоретической детекцией.
Молекулярные методы выявляют геномные последовательности и живых, и погибших микроорганизмов, пока нуклеиновая кислота сохраняется в пробе. Отсюда частое расхождение: проба положительна в ПЦР и отрицательна при выделении вируса. ВОЗЖ советует разбирать такие случаи секвенированием или другим молекулярным методом.
Анализ распадается на четыре шага: приём и первичная обработка материала, выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционной смеси и амплификация, учёт результата. МУ 1.3.2569-09 превращает эти шаги в последовательные рабочие зоны (п. 5.8):
Реакционные смеси готовят до того, как в зону 3 доставят пробы из зоны 2 (п. 5.11.1). Саму зону 3 рекомендуют делить на подзоны 3а (смеси и обратная транскрипция) и 3б (амплификация и учёт) в отдельных помещениях (п. 5.11.2). Зоны 4-1 и 4-2 размещают изолированно от зон 1–3, чтобы продукты амплификации не попали туда с воздушным потоком; объединять их запрещено (п. 5.12, 5.12.3). Мебель и оборудование каждой зоны маркируют, применять в других зонах не разрешается (п. 5.14.2). В зоне 3 приток воздуха равен вытяжке, в зонах 1 и 2 вытяжка преобладает (п. 5.13.1, 5.13.2). Измерительные приборы поверяют не реже раза в год (п. 5.15).
Руководство ВОЗЖ требует того же по смыслу. Из-за высокой чувствительности метода нужны отдельные помещения или боксы под отдельные этапы, смена халатов и перчаток, строгая программа уборки.
Выбор набора начинается с того, из чего состоит геном возбудителя. ДНК-мишени – например, вирус африканской чумы свиней (АЧС), вирус нодулярного дерматита, провирус лейкоза КРС. РНК-мишень – например, вирус гриппа А.
Для РНК перед амплификацией ставят обратную транскрипцию: фермент синтезирует кДНК, и дальше идёт обычная ПЦР. Поэтому набор ПЦР-ГРИПП-А-ФАКТОР работает в формате ОТ ПЦР РВ. Набор для выделения ДНК/РНК-С-ФАКТОР по описанию производителя предназначен для экстракции ДНК/РНК с последующим проведением обратной транскрипции и ПЦР.
Из этого следуют три практических вывода. В перечень контролей для теста на РНК ВОЗЖ добавляет контроль обратной транскрипции. Руководство MIQE требует оценивать остаточную геномную ДНК в препаратах РНК: для этого сравнивают Cq с обратной транскрипцией и без неё. РНК-вирусы быстро меняются, точковые мутации возможны, поэтому ВОЗЖ советует периодически перепроверять последовательности праймеров и зондов.
Прибор измеряет флуоресценцию после каждого цикла. Номер цикла, на котором сигнал пересекает порог, в руководстве ВОЗЖ обозначают Ct (cycle threshold), в руководстве MIQE – Cq (quantification cycle).
Cq показывает положение кривой амплификации относительно оси циклов и напрямую связан с исходной концентрацией мишени: чем больше копий в реакции, тем раньше кривая пересекает порог. Дальше начинаются ограничения. Значения Cq различаются между постановками и приборами, поэтому их нельзя сравнивать между лабораториями. Они сильно зависят от эффективности ПЦР, которая различается у разных наборов и даже у разных проб. На разброс влияют установка порога, эффективность реакции, количество исходного материала, артефакты реакции, ошибки пипетирования и вариация выборки.
Порог отсечения задаёт инструкция к набору. ВОЗЖ приводит пример: иногда уместен порог около 35 циклов, и тогда пробы с большим Ct относят к отрицательным или сомнительным. Для другой ПЦР положительным считают любой зарегистрированный Ct. Значения между положительным и отрицательным порогами называют сомнительной зоной. Выбирая порог, учитывают характеристики конкретной ПЦР, данные валидации, назначение результата и ветеринарные сведения о животном.
В карточках наборов на АЧС, грипп А, нодулярный дерматит и лейкоз КРС указана комплектация: 55 или 110 реакций, включая контроли (ВКО, ПКО, ОКО). Расшифровку и правила учёта смотрят в инструкции к набору. По смыслу они закрывают разные риски.
| Контроль | Что показывает | Как часто ставят |
|---|---|---|
| Отрицательный, проба без матрицы | контаминацию: сигнал там, где продукта быть не должно | ВОЗЖ: около 5% лунок, случайно по планшету. MIQE: в каждой постановке, загружают последними |
| Положительный | что реакция прошла; его Ct попадает в заданный рабочий диапазон | на каждый планшет |
| Внутренний, на ингибиторы | что в пробе нет веществ, подавляющих реакцию | к каждой пробе, если ингибиторы существенны для этой матрицы |
| Вида-хозяина | что в пробу действительно попал материал от нужного вида животного | для «косвенных» проб, например собранных на тампон, – к каждой пробе |
| Обратной транскрипции | что прошёл этап синтеза кДНК | в тестах на РНК-возбудителей |
Положительный контроль в виде плазмиды проверяет амплификацию, но не качество выделения. Для оценки выделения нужна известная положительная проба. Внутренний контроль не сработал – значит, в пробе есть ингибиторы, и отрицательный результат по мишени недостоверен. MIQE подчёркивает отдельно: положительные контроли нужны там, где копий мало и важна уверенность в отрицательном результате, то есть именно при выявлении патогенов.
Стабильность набора отслеживают по контрольным картам значений Ct для рабочих контрольных проб и через участие в межлабораторных сравнительных испытаниях.
Результат лаборатории зависит от качества и пригодности проб. Материал определён в назначении каждого набора.
| Набор (кат. №) | Мишень | Материал по карточке набора |
|---|---|---|
| ПЦР-АЧС-ФАКТОР (D10415-VET) | ДНК вируса АЧС | цельная кровь, плазма и сыворотка крови, мазки со слизистой носоглотки и миндалин, фрагменты миндалин, селезёнки, лёгких, печени, лимфоузлы и др. |
| ПЦР-НОДУЛЯРНЫЙ-ДЕРМАТИТ-КРС-ФАКТОР (D21416-VET) | ДНК вируса нодулярного дерматита | фрагменты поражённых кожных покровов, органы, цельная кровь, мазки со слизистых конъюнктивы и ротоглотки, молоко, сперма |
| ПЦР-ГРИПП-А-ФАКТОР (R10515-VET) | РНК вируса гриппа А | фекалии и помёт, мазки со слизистой глотки и трахеи, соскобы из клоаки птиц, фрагменты внутренних органов, куриные эмбрионы, корма и продукты животного происхождения |
| ПЦР-ЛЕЙКОЗ-КРС-ФАКТОР (D11816-VET) | ДНК провируса лейкоза КРС | цельная кровь; продукты питания (фарш, колбаса, шпик и др.) |
Часть матриц заведомо трудная. Фекалии, сперма и аутолизированные ткани обычно содержат больше ингибиторов, чем кровь и культуры. Клоакальные пробы дают ингибиторы чаще, чем пробы из ротовой полости. Влияет и материал тампона: в некоторых тампонах есть вещества, подавляющие реакцию. Отдельные тесты несовместимы с гепарином, формалином, сухим льдом и даже с замораживанием.
Сроки и антикоагулянты заданы ветеринарными правилами по конкретной болезни:
Пробы на тампонах держат влажными в транспортной среде, рекомендованной для конкретного теста. Фекалии держат охлаждёнными, например при 4 °C или на льду, и исследуют как можно быстрее после отбора.
Положительный результат говорит об одном: в пробе есть мишень. Дальше нужны уточнения.
Юридический вес результата задают правила по конкретной болезни. Диагноз на АЧС считается установленным при выделении возбудителя и (или) обнаружении его антигена, и (или) генетического материала, и (или) антител к возбудителю (п. 28 Правил № 37).
В Правилах № 156 по лейкозу перечень оснований для диагноза иной: гематологическое, гистологическое и серологические исследования. ПЦР в этом перечне не названа, хотя молекулярно-биологические исследования правила предписывают проводить именно методом ПЦР (п. 20, 21). Здесь и выше Правила № 156 цитируются в редакции, действующей с 1 сентября 2025 года: приказ Минсельхоза России от 8 апреля 2025 г. № 229 изменил в том числе пункты 18, 19 и 21 и дополнил правила пунктом 21(1).
Лабораторная часть разбора опирается на руководство ВОЗЖ:
Две обязанности лаборатории Правила № 37 задают независимо от того, сомнительным вышел результат или нет. Все доставленные пробы делят на две равные части. Вторую хранят не менее 30 календарных дней при температуре от минус 15 до минус 40 °С: по ней проводят повторные исследования по запросу тех, кто оспаривает результат (п. 26). О полученных результатах руководитель лаборатории письменно сообщает в течение 12 часов руководителю регионального органа ветеринарии и специалисту госветслужбы, направившему материал (п. 29).
СанПиН 3.3686-21 (постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 № 4) в п. 140 отсылает к требованиям по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности. Конкретный документ пункт не называет. Действующий документ с таким названием – МУ 1.3.2569-09, утверждённые 22 декабря 2009 года: зонирование, поточность движения проб, маркировка оборудования, вентиляция, поверка приборов.
Руководство ВОЗЖ добавляет уровень системы качества. Для признания результатов и аккредитации по ISO/IEC 17025 лаборатории нужна система менеджмента качества. В неё входят валидированные методики и подтверждённая квалификация, в том числе через регулярное участие в межлабораторных сравнительных испытаниях.
Конкретные пробы, сроки и основания для диагноза ищут в ветеринарных правилах по болезни. Сравнение Правил № 37 и Правил № 156 показывает, насколько по-разному оформлена роль ПЦР при разных болезнях.
В разделе ПЦР каталога более 130 наборов собственного производства, более 100 из них для выявления возбудителей болезней животных, птицы, рыб и пчёл. Фасовка указана в карточке набора, у большинства это 55 и 110 реакций.
Для выделения нуклеиновых кислот:
Примеры ПЦР-наборов под разные типы мишеней:
Инструкции открываются в личном кабинете после подтверждения доступа, их также можно запросить кнопкой «Запросить инструкцию» в карточке набора. Подобрать наборы под задачи и оборудование лаборатории помогут специалисты ВЕТ ФАКТОР: +7 (495) 789-48-11, vet@faktor.ru.
ПЦР ищет нуклеиновую кислоту возбудителя, ИФА – антитела или антиген. Правила № 37 допускают оба метода (п. 27). Диагноз на АЧС считают установленным при выделении возбудителя и (или) обнаружении его антигена, и (или) генетического материала, и (или) антител к возбудителю (п. 28).
Нет. Ct связан с количеством копий мишени в реакции, но зависит от порога, эффективности ПЦР, качества выделения и прибора. Значения не сопоставимы между лабораториями, поэтому их не переносят из чужого протокола и не трактуют как меру тяжести.
Такое расхождение описано в руководстве ВОЗЖ: молекулярные методы выявляют последовательности и живых, и погибших микроорганизмов. Разбирают расхождение секвенированием или другим молекулярным методом.
Причины бывают такие: не сработал внутренний контроль (ингибиторы в матрице), нарушены сроки доставки, материал не подходит для теста. Все три делают отрицательный результат неинформативным.
Исследования по детекции нуклеиновых кислот ПБА проводят по требованиям к лабораториям, использующим методы амплификации (п. 140 СанПиН 3.3686-21). МУ 1.3.2569-09 допускают не только отдельные помещения, но и выделенные рабочие зоны в составе других помещений при соблюдении поточности (п. 5.2, 5.8).
Материал носит справочный характер и не заменяет ветеринарные правила и заключение ветеринарного специалиста. Диагноз устанавливают по результатам лабораторных исследований в порядке, установленном законодательством.
© 2015 – 2026 ООО «ВЕТ ФАКТОР» Все права защищены.
